全(quán)國(guó)統(tǒng)一(yī)銷售熱綫(xiàn)：
全(quán)國(guó)統(tǒng)一(yī)銷售熱綫(xiàn)：產品列表PRODUCTS LIST
斑馬魚胚胎顯微注(zhù)射(shè)實驗操作(zuò)方法
顯(xiǎn)微(wēi)注射技(jì)術(shù)是(shì)在顯微鏡下，利(lì)用顯微(wēi)操作(zuò)係統(tǒng)，控(kòng)製(zhì)顯微注射針在(zài)顯微(wēi)鏡(jìng)視野(yě)內(nèi)移動，對進(jìn)行(háng)細胞(bāo)或早(zǎo)期胚(pēi)胎(tāi)操作的一(yī)種(zhǒng)方法。該技術(shù)已經(jīng)在越(yuè)來越(yuè)多的(dí)實驗(yàn)生(shēng)物(wù)學(xué)研(yán)究領(lǐng)域中成為一(yī)項(xiàng)普(pǔ)遍的操作技(jì)術，並成功運(yùn)用於(yú)包括小鼠，大鼠，兔子(zǐ)，斑(bān)馬(mǎ)魚(yú)及(jí)許多大(dà)型(xíng)家(jiā)畜，如牛，羊(yáng)，豬等動物(wù)中。
斑馬(mǎ)魚(yú)顯(xiǎn)微(wēi)注射是(shì)將實驗材料(liào)直(zhí)接(jiē)注射到1-4細胞期的斑馬(mǎ)魚(yú)胚胎中，由於在這(zhè)個胚胎(tāi)發(fā)育早(zǎo)期沒有(yǒu)膜分(fēn)隔細胞和(hé)卵(luǎn)黃，注入1個(gè)細胞(bāo)或卵(luǎn)黃(huáng)的(dí)溶(róng)液將(jiāng)擴(kuò)散到(dào)整(zhěng)個(gè)胚胎(tāi)中。通(tōng)過(guò)注(zhù)射(shè)不同(tóng)類型(xíng)的實(shí)驗樣(yàng)品(pǐn)，實(shí)現基因的(dí)瞬時過表達（over-expression），表達敲減（knock-down），以(yǐ)及(jí)製備(bèi)轉基(jī)因(yīn)或(huò)突變斑(bān)馬魚品(pǐn)係(xì)等研究(jiū)。
一(yī)， 胚(pēi)胎(tāi)顯微注(zhù)射(shè)技術的(dí)應用
斑馬魚作(zuò)為(wéi)一(yī)種新興的理想(xiǎng)的模式生物，在生(shēng)命(mìng)科學研究中(zhōng)已得到(dào)廣泛(fàn)應用，斑(bān)馬(mǎ)魚胚(pēi)胎顯(xiǎn)微(wēi)注射(shè)技術(shù)是這些應用研究(jiū)的(dí)基礎(chǔ)技(jì)術(shù)平(píng)台(tái)之一。通過(guò)顯微注射不(bù)同的實驗樣品(pǐn)，可以實現(xiàn)以下(xià)不同的目(mù)的(dí)。
（一）可(kě)以(yǐ)通過(guò)注射體(tǐ)外(wài)合(hé)成(chéng)的mRNA實現目(mù)的基因(yīn)的(dí)過表(biǎo)達，並通(tōng)過觀察(chá)表(biǎo)型(xíng)推(tuī)測目的(dí)基(jī)因(yīn)的功能(néng)。
（二）可以(yǐ)通過注射反義(yì)嗎(má)啉環寡核(hé)苷(gān)酸（morpholino）敲減目的基因的表(biǎo)達(dá)。morpholino是(shì)穩定的人(rén)工(gōng)合(hé)成的核酸類似(sì)物，通(tōng)過標準(zhǔn)的鹼(jiǎn)基(jī)互補配對(duì)與(yǔ)mRNA結合，阻斷(duàn)蛋(dàn)白(bái)翻(fān)譯或(huò)mRNA剪切。與(yǔ)過表(biǎo)達(dá)相(xiāng)反，這種方(fāng)法導致(zhì)mRNA蛋白(bái)產物(wù)減少，可以通過該蛋白減少時對生(shēng)物學過程(chéng)的改變(biàn)來(lái)解(jiě)釋(shì)目的(dí)基因在發育(yù)中所扮(bàn)演(yǎn)的(dí)角色(sè)。
（三）基因敲除(chú)（knock-out）品(pǐn)係(xì)的研(yán)製(zhì)。基因敲除(chú)品係(xì)是(shì)在活體動(dòng)物上(shàng)開(kāi)展(zhǎn)基(jī)因功能研(yán)究(jiū)的重要工(gōng)具(jù)。CRISPR-Cas9技(jì)術是(shì)一(yī)種(zhǒng)高效(xiào)，快速(sù)的構建敲(qiāo)除品係的(dí)新方(fāng)法(fǎ)。這個技(jì)術的(dí)原理是通過(guò)人(rén)工設(shè)計出sgRNA，sgRNA能夠通過(guò)鹼(jiǎn)基配對識(shí)別目標序列，然(rán)後(hòu)引導體外合成(chéng)的(dí)核(hé)酸(suān)內(nèi)切(qiē)酶(méi)Cas9蛋(dàn)白在(zài)目(mù)標(biāo)靶(bǎ)點(diǎn)產(chǎn)生切割(gē)。DNA斷裂(liè)後(hòu)，細胞(bāo)將通過(guò)非同源(yuán)末(mò)端(duān)接合(hé)(NHEJ)修復(fù)機製來進(jìn)行(háng)修復，將(jiāng)斷裂的(dí)DNA重新(xīn)連(lián)接起(qǐ)來，在這個過程中(zhōng)會產生DNA鹼基的(dí)插入或缺失(shī)的(dí)錯誤(wù)，從而引(yǐn)起DNA突(tū)變。
（四）轉基(jī)因品係的(dí)研製(zhì)。轉(zhuǎn)基(jī)因技術(shù)是將人(rén)工分(fēn)離和修飾(shì)過(guò)的(dí)基因導入(rù)到(dào)生(shēng)物體基因組(zǔ)中，由於(yú)導入(rù)基因的(dí)表達(dá)，引起(qǐ)生物(wù)體(tǐ)的性狀(zhuàng)產(chǎn)生可(kě)遺傳的修飾(shì)。在轉基(jī)因(yīn)品(pǐn)係(xì)研製中(zhōng)，轉基(jī)因(yīn)載體(tǐ)是承載(zǎi)外(wài)源(yuán)基因，攜帶(dài)靶基因(yīn)進入斑馬魚胚胎細胞，並將(jiāng)目的(dí)基(jī)因整合(hé)到(dào)斑(bān)馬魚基(jī)因(yīn)組使其(qí)穩(wěn)定(dìng)維(wéi)持的DNA分子。顯(xiǎn)微注(zhù)射是製備轉(zhuǎn)基(jī)因斑(bān)馬魚(yú)過程(chéng)中(zhōng)常用(yòng)的(dí)方法(fǎ)。
二(èr)， 顯微(wēi)注(zhù)射係統(tǒng)的搭建
斑(bān)馬魚顯(xiǎn)微(wēi)注射需有一(yī)套相(xiāng)當(dāng)精密的(dí)顯微操(cāo)作(zuò)設備(bèi)，主(zhǔ)要包括以下幾種（圖4.1）：
圖(tú)4.1顯微注射常用(yòng)設備(bèi)。A: SUTTERP-1000微(wēi)電極拉(lā)製儀(yí); B: ASI顯微注射(shè)儀MPPI-3;
C: 持針(zhēn)器和(hé)顯(xiǎn)微操(cāo)作(zuò)儀MM33; D：體視(shì)顯(xiǎn)微鏡
微電極拉製儀用於拉製毛(máo)細(xì)管成注射針(zhēn)，可(kě)以調(tiáo)節的(dí)溫度，拉(lā)力，拉製(zhì)時間等(děng)參數(shù)拉(lā)製出合適針(zhēn)尖的注射(shè)針，為(wéi)了防止(zhǐ)空氣(qì)中灰塵(chén)顆(kē)粒(lì)沾染注(zhù)射(shè)針(zhēn)引(yǐn)起(qǐ)針(zhēn)尖阻塞(sāi)，注射(shè)針(zhēn)現(xiàn)用現拉(lā)。
顯(xiǎn)微注(zhù)射(shè)儀用於注射(shè)針內(nèi)的溶(róng)液(yè)施(shī)加壓力(lì)脈衝(chōng)，利用(yòng)可(kě)調節(jié)氣壓脈衝將(jiāng)精(jīng)準(zhǔn)體積(jī)的樣(yàng)品注射(shè)至胚胎體內(nèi)。注射(shè)器還和(hé)一個腳踏板(bǎn)相連(lián)，使得實驗(yàn)人員在使(shǐ)用雙(shuāng)手的同時還可以激活壓(yā)力(lì)脈(mài)衝將實(shí)驗(yàn)材(cái)料注射(shè)入(rù)胚(pēi)胎(tāi)中；
持針器用於(yú)固定(dìng)在(zài)注射(shè)過程中使用(yòng)的注(zhù)射針，並將它與(yǔ)注(zhù)射(shè)器的空氣(qì)管相(xiāng)連(lián)，常(cháng)裝(zhuāng)在顯(xiǎn)微操(cāo)作器(qì)上；
顯(xiǎn)微(wēi)操(cāo)作儀用(yòng)於(yú)注射(shè)針的(dí)顯微操縱，可以(yǐ)在(zài)顯微(wēi)注射(shè)過程(chéng)中對(duì)注射(shè)針的位置(zhì)進(jìn)行(háng)細小(xiǎo)和(hé)精準(zhǔn)地調節；
體視顯微(wēi)鏡用於(yú)顯微注射(shè)時(shí)觀(guān)察胚胎，可(kě)以在(zài)顯微注射過(guò)程中(zhōng)看到(dào)胚胎並對(duì)注射針(zhēn)所(suǒ)在(zài)的位置(zhì)聚(jù)焦。
三， 顯微(wēi)注射(shè)過程(chéng)及注意事(shì)項
顯(xiǎn)微(wēi)注射技術是一(yī)個(gè)相(xiāng)對(duì)精細的(dí)實驗操(cāo)作(zuò)，主要有以(yǐ)下步(bù)驟。
（一）準(zhǔn)備(bèi)注射用的(dí)胚胎(tāi)
注射(shè)的(dí)前(qián)1DAY，按照雌(cí):雄為1:1或(huò)2 :1的(dí)比例(lì)將(jiāng)成(chéng)年斑馬魚(yú)放(fàng)置(zhì)於配種缸，用隔板(bǎn)分(fēn)開（圖2.3）。
注(zhù)射的(dí)早(zǎo)上，抽(chōu)去隔(gé)板，雌(cí)雄魚(yú)開(kāi)始(shǐ)交配。一(yī)般在十(shí)多分鐘(zhōng)左(zuǒ)右(yòu)親魚產卵(luǎn)並(bìng)使(shǐ)卵受(shòu)精。一(yī)般(bān)一次(cì)抽(chōu)板2缸(gāng)魚左右，隨(suí)後(hòu)根(gēn)據(jù)實驗進(jìn)度適(shì)時給其它缸抽板(bǎn)。可在抽板前(qián)先將(jiāng)內缸(gāng)連(lián)同親(qīn)魚換到另一幹(gān)淨(jìng)外缸中以(yǐ)節約清潔(jié)胚(pēi)胎(tāi)的時間(jiān)。
親魚產卵後(hòu)，取(qǔ)180μm孔徑的(dí)過濾(lǜ)網(wǎng)，收集外缸底(dǐ)部的(dí)魚(yú)卵(luǎn)，並用養殖(zhí)水清洗(xǐ)魚(yú)卵2-3次。應(yīng)盡(jìn)量(liáng)收(shōu)集(jí)20 min內(nèi)的(dí)受(shòu)精(jīng)卵（即對於同(tóng)一(yī)缸(gāng)親魚，兩次收(shōu)集受精卵的時(shí)間間隔不(bù)得(dé)超(chāo)過20分鐘(zhōng)，以保證發育階(jiē)段的一致性(xìng)）。受精卵(luǎn)分選(xuǎn)和(hé)洗淨(jìng)後(hòu)，用(yòng)吸(xī)管將(jiāng)收(shōu)集(jí)的(dí)卵置(zhì)於(yú)平(píng)板(bǎn)培養皿中，去(qù)除平(píng)皿(mǐn)內的異物(wù)和胚(pēi)胎(tāi)周圍的(dí)水(shuǐ)，采用(yòng)幹法(fǎ)注(zhù)射。
胚胎在(zài)受(shòu)精後10分鐘(zhōng)卵膜將膨(péng)脹，隨後數分(fēn)鐘內(nèi)細(xì)胞形態變得較為規整（容易(yì)找到(dào)動(dòng)物極），此時(shí)可(kě)以開(kāi)始注射。受精後45分(fēn)鐘(zhōng)左右(yòu)（標(biāo)準(zhǔn)培育(yù)溫(wēn)度(dù)下所需時(shí)間(jiān)，具(jù)體(tǐ)情(qíng)況(kuàng)同(tóng)室溫(wēn)有關）發生(shēng)一次(cì)卵裂。樣品(pǐn)通(tōng)常需要注射到1-4細胞時期胚胎(tāi)，以下(xià)上樣，斷針(zhēn)，定量(liáng)和(hé)注(zhù)射(shè)都要在此(cǐ)段(duàn)時間內或(huò)在此之前完(wán)成(chéng)。
（二(èr)）拉(lā)針(zhēn)，上(shàng)樣和儀器準備工作(zuò)
1，拉(lā)針(zhēn)。使用(yòng)微電極(jí)拉製儀拉製(zhì)一定數(shù)量的毛(máo)細(xì)管，應提前(qián)準備。
2，可以(yǐ)提前(qián)準備(bèi)，樣品通常包括(kuò)質粒DNA，RNA，morpholino等(děng)。
DNA質粒樣(yàng)品(pǐn)：質(zhì)粒(lì)DNA需使用(yòng)“去內毒。素(sù)"的(dí)試(shì)劑盒(hé)提取。一般注射(shè)量(liáng)為(wéi)每(měi)枚胚胎20-150pg，多(duō)於200pg胚胎(tāi)死亡(wáng)率(shuài)上升。
mRNA樣品：一般注(zhù)射(shè)量(liáng)為(wéi)每枚(méi)胚(pēi)胎(tāi)10-500pg，針對不同(tóng)的mRNA樣(yàng)品，需(xū)要摸索(suǒ)各(gè)自適(shì)宜(yí)的(dí)濃度。
Morpholino樣品(pǐn)：參見GeneTools公(gōng)司隨(suí)樣(yàng)品提(tí)供的(dí)說明書。通常(cháng)產品總量為(wéi)300nmol一瓶(píng)，約(yuē)相(xiāng)當於2400μg，加(jiā)入(rù)200μL滅(miè)過菌(jūn)的(dí)去離子(zǐ)水（電阻(zǔ)率(shuài)>18MΩ/cm）稀釋至12μg/μL，每(měi)管(guǎn)20μL分(fēn)裝作為儲(chǔ)液凍存(cún)在(zài)－20℃。注射時取一(yī)管稀釋至(zhì)0.5-6μg/μL (ng/nL)左右(yòu)。針對不(bù)同的(dí)morpholino，需摸索各自合(hé)適(shì)的濃度，以(yǐ)獲(huò)得理(lǐ)想的(dí)表型(xíng)而不產(chǎn)生(shēng)毒性效應為(wéi)宜。在使(shǐ)用(yòng)新的morpholino時，必(bì)須(xū)慎(shèn)重考(kǎo)量該morpholino的(dí)有效(xiào)性和特(tè)異性(xìng)。
所(suǒ)有樣品(pǐn)使用前需(xū)要(yào)先離心(xīn)，使(shǐ)可(kě)能(néng)存(cún)在的固體(tǐ)懸浮(fú)物沉(chén)澱到(dào)管(guǎn)底，避(bì)免堵(dǔ)住針(zhēn)頭。一(yī)般可以(yǐ)在注射(shè)樣品(pǐn)中加入終濃(nóng)度10%-20%的酚紅(hóng)，便於(yú)觀察(chá)注射過(guò)程。
3，上(shàng)樣裝針(zhēn)。將(jiāng)拉製好的(dí)毛(máo)細管豎直固定。然(rán)後吸(xī)取(qǔ)1-3μl顯微注(zhù)射液，逐滴(dī)地將(jiāng)注(zhù)射液滴(dī)在(zài)毛細管(guǎn)頂(dǐng)端，在(zài)毛(máo)細管(guǎn)內芯(xīn)引導下，液體通(tōng)過(guò)虹(hóng)吸作(zuò)用(yòng)將匯(huì)聚(jù)於玻璃管針頭(tóu)部分。如果使用的毛細(xì)管(guǎn)沒有內芯，可以使用微量上(shàng)樣(yàng)移液(yè)槍(qiāng)頭上(shàng)樣。上樣(yàng)體(tǐ)積(jī)至少(shǎo)為(wéi)1μL，一定(dìng)不(bù)要在(zài)針(zhēn)內(nèi)引(yǐn)入(rù)空(kōng)氣柱(zhù)，否則會難(nán)以(yǐ)控(kòng)製(zhì)注射量。
4，打開(kāi)顯微(wēi)注射(shè)儀。以(yǐ)MPPI-3脈衝壓(yā)力注(zhù)射儀為(wéi)例。打開氮氣(qì)罐(guàn)總閥(fá)，調節(jié)壓力(lì)至(zhì)0-0.5之(zhī)間。打(dǎ)開(kāi)注(zhù)射儀開(kāi)關，調節(jié)主(zhǔ)操(cāo)作(zuò)麵(miàn)板上的壓力(lì)值(zhí)為(wéi)10-20左右，選(xuǎn)擇(zé)合適(shì)的注(zhù)射壓力和脈衝(chōng)時間(jiān)。（圖4.2）
圖4.2 全(quán)套(tào)搭建(jiàn)好(hǎo)的(dí)顯微注射設(shè)備(bèi)（左(zuǒ)側(cè)）和破(pò)針操作（右側(cè)）
（三(sān)）注射(shè)斑(bān)馬(mǎ)魚胚(pēi)胎(tāi)
1，破針。將上好樣(yàng)品的(dí)注射針插(chā)入持(chí)針(zhēn)器中固(gù)定，然後(hòu)在體(tǐ)視鏡(jìng)高(gāo)倍放大(dà)率下，用尖頭鑷(niè)子(zǐ)將注(zhù)射針的前端夾(jiā)斷。（圖(tú)4.2）
2，注射劑量調(tiáo)整(zhěng)。把(bǎ)台微尺放置到體視(shì)顯(xiǎn)微鏡(jìng)下(xià)，加入一滴礦物油(yóu)，將(jiāng)注射(shè)針(zhēn)伸入礦物(wù)油(yóu)中，踩(cǎi)動踏(tà)板(bǎn)壓將(jiāng)一(yī)滴(dī)注(zhù)射液送(sòng)到(dào)礦(kuàng)物(wù)油(yóu)，測量(liáng)注射樣品(pǐn)的(dí)大小。注射(shè)體(tǐ)積(jī)與針尖大(dà)小(xiǎo)，注射(shè)壓(yā)力(lì)，注(zhù)射時間，溶(róng)液(yè)粘度和外部(bù)壓力(lì)有(yǒu)關，理想的注射劑(jì)量為(wéi)胚胎體積(jī)的10%，一般為1nL（注射(shè)樣品(pǐn)的(dí)直徑在(zài)10個小(xiǎo)格(gé)左右）。注射(shè)劑(jì)量(liáng)過大體積會(huì)損傷(shāng)胚胎(tāi)，過(guò)小(xiǎo)可能影響(xiǎng)定(dìng)量(liáng)精準(zhǔn)度(dù)和(hé)擴(kuò)散的(dí)均匀程(chéng)度(dù)。
3，注(zhù)射(shè)。將收(shōu)集的胚胎放置(zhì)到體(tǐ)視顯(xiǎn)微(wēi)鏡鏡(jìng)下(xià)，用(yòng)低倍物鏡(jìng)對準(zhǔn)胚(pēi)胎調焦，輕(qīng)輕的(dí)落下(xià)針尖(jiān)，並(bìng)將注射(shè)針尖推入視(shì)野中心(xīn)，通(tōng)過微(wēi)操(cāo)作(zuò)係統(tǒng)的微調(tiáo)調(tiáo)整(zhěng)注(zhù)射針位置，直(zhí)到清(qīng)晰見(jiàn)到(dào)針(zhēn)尖為止(zhǐ)。進一步(bù)調整顯(xiǎn)微(wēi)鏡焦(jiāo)距和注射針及(jí)胚胎(tāi)的位置，使胚胎和(hé)注射(shè)針(zhēn)尖均(jūn)達到非常清晰程(chéng)度(dù)。推動操(cāo)縱杆，小(xiǎo)心進針，使注(zhù)射針(zhēn)針(zhēn)尖進入胚(pēi)胎。腳(jiǎo)踏(tà)開(kāi)關(guān)將樣品(pǐn)注入胚胎(tāi)。實驗結(jié)束(shù)時，先(xiān)關(guān)閉氮氣(qì)罐(guàn)總閥(fá)（逆時(shí)針變(biàn)鬆為關），排(pái)空儀(yí)器(qì)中(zhōng)的氣體(tǐ)後，關(guān)閉總開(kāi)關(guān)。
（四）注射胚(pēi)胎的(dí)培養和觀察
1，胚(pēi)胎養殖。注射結束(shù)後，將(jiāng)胚胎(tāi)轉移至(zhì)養殖水(shuǐ)中(zhōng)，置入28?C培養箱(xiāng)培(péi)養。待胚胎(tāi)發育2小時後，顯(xiǎn)微(wēi)鏡下(xià)挑出未(wèi)受精的胚胎和死亡(wáng)的(dí)胚(pēi)胎(tāi)。孵(fū)化期(qī)間每天要及(jí)時去除(chú)敗(bài)育胚胎(tāi)，勤換(huàn)水。
2，胚胎麻(má)醉(zuì)和固定(dìng)。麻醉(zuì)劑可以使魚類代(dài)謝減緩(huǎn)，鰓動頻(pín)率(shuài)下降，氧的需(xū)求(qiú)量(liáng)減少(shǎo)，從而方(fāng)便進行實驗(yàn)操作。通常將斑(bān)馬魚(yú)浸泡(pào)於0.016%的(dí)Tricaine中進(jìn)行(háng)麻(má)醉。待胚胎麻(má)醉後，利(lì)用4%的甲(jiǎ)基(jī)纖維(wéi)素(sù)固(gù)定胚胎，將胚胎調整到合(hé)適的(dí)位(wèi)置。廢棄的顯微注射針的尖兒端燒溶後可以(yǐ)用(yòng)於調整胚胎。
3，胚胎觀(guān)察(chá)。為了便於(yú)觀(guān)察(chá)顯(xiǎn)微(wēi)注射(shè)的(dí)結果(guǒ)，本次培訓使用質粒pT2(tpma:EGFP)和(hé)chordin mopholino作為注射練習的(dí)材料(liào)。質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)注(zhù)射後(hòu)，胚胎發育(yù)至1天時，在肌肉(ròu)中特異(yì)表達綠(lǜ)色熒光蛋白(bái)；chordin mopholino注射(shè)後的(dí)胚胎出現(xiàn)腹部(bù)化(huà)（ventralization）。（圖4.3）
圖(tú)4.3 顯微注射(shè)後(hòu)24hpf胚(pēi)胎(tāi)的(dí)照片。胚胎發(fā)育至1天時(shí)，注射質粒(lì)pT2(tpma:EGFP)的(dí)胚胎在肌肉細胞(bāo)中特異(yì)表(biǎo)達綠(lǜ)色(sè)熒光蛋(dàn)白（A）；注射(shè)chordin mopholino的胚(pēi)胎產(chǎn)生腹部(bù)化(huà)表(biǎo)型(xíng)（B）。
顯(xiǎn)微注射的注(zhù)意(yì)事(shì)項
顯(xiǎn)微注(zhù)射(shè)的操(cāo)作(zuò)過程(chéng)中有(yǒu)許多細節影響實(shí)驗的(dí)成功率(shuài)，需要特別關注，主(zhǔ)要包(bāo)括以(yǐ)下幾(jī)方麵(miàn)。
1，注射(shè)樣(yàng)品(pǐn)的質量和(hé)和濃度(dù)。顯微(wēi)注(zhù)射(shè)的(dí)樣品(pǐn)種類(lèi)繁多，包(bāo)括mRNA，DNA或蛋(dàn)白質等，但(dàn)是(shì)注射(shè)樣(yàng)品(pǐn)是(shì)否(fǒu)純(chún)淨是(shì)關(guān)係到(dào)注(zhù)射效率(shuài)高低的重要因素之(zhī)一(yī)。此外，注射(shè)樣(yàng)品的濃度不(bù)易太(tài)高，例(lì)如(rú)注(zhù)射DNA的(dí)總(zǒng)濃(nóng)度一般(bān)控(kòng)製在200pg以(yǐ)下。
2，注(zhù)射(shè)前(qián)小心將顯(xiǎn)微注射針(zhēn)定(dìng)位(wèi)，注射針(zhēn)定(dìng)位到(dào)卵表麵(miàn)的注(zhù)射(shè)角度是(shì)穿透堅硬(yìng)的(dí)卵(luǎn)殼(ké)注(zhù)射成(chéng)功的(dí)關鍵。
3，破(pò)針(zhēn)時，將(jiāng)針尖(jiān)一點(diǎn)點(diǎn)剪(jiǎn)斷，不(bù)宜一次剪太(tài)多。顯微注(zhù)射(shè)針尖如(rú)果太(tài)粗，會(huì)導(dǎo)致DNA流(liú)量過多(duō)，受(shòu)精卵易(yì)於裂(liè)解；太(tài)細則導致針(zhēn)內(nèi)DNA流出(chū)速率(shuài)過慢(màn)，且(qiě)易(yì)堵塞針(zhēn)尖，而(ér)使(shǐ)DNA無(wú)法順利流(liú)入，影響注射效率。因此(cǐ)進行顯(xiǎn)微(wēi)注射時，如何製(zhì)備(bèi)適用的(dí)顯(xiǎn)微注(zhù)射針(zhēn)是顯微注射效(xiào)率極其重要的(dí)因素(sù)。
4，在(zài)注(zhù)射(shè)過程(chéng)中(zhōng)，常發生(shēng)注射(shè)針堵塞(sāi)，堵(dǔ)塞後，通(tōng)常(cháng)可(kě)通過輕夾針尖，增(zēng)大輸(shū)出壓(yā)力(lì)或按pulse/CONT開關而(ér)得(dé)以緩解(jiě)。如果不(bù)能解決，換用(yòng)新(xīn)的(dí)注射(shè)針。
5，注射(shè)時注(zhù)射(shè)器(qì)的壓力(lì)不宜變化太快(kuài)，否則(zé)會(huì)造成注(zhù)射(shè)量(liáng)操作難(nán)以(yǐ)控(kòng)製(zhì)，導致胚(pēi)胎(tāi)內環境改變過(guò)快過大甚至(zhì)脹破細(xì)胞(bāo)。氮(dàn)氣罐的壓(yā)力閥(fá)顯示氣(qì)體(tǐ)的(dí)壓(yā)力(lì)，壓力為(wéi)0表(biǎo)明(míng)罐(guàn)內無氣體(tǐ)，需要(yào)及(jí)時換氣(qì)。
6，注射(shè)完畢，慢慢抽(chōu)出注(zhù)射(shè)針(zhēn)，要一氣(qì)呵成(chéng)，避(bì)免(miǎn)受精卵內物(wù)質隨著(zhuó)毛細針抽出，造(zào)成受(shòu)精卵的(dí)損(sǔn)傷。
7，在整(zhěng)個過(guò)程(chéng)中，嚴禁將(jiāng)注(zhù)射針尖(jiān)對(duì)著人員(yuán)和儀(yí)器(qì)，因為注射針在持(chí)針器(qì)上安裝不(bù)牢時或針尖堵塞(sāi)，注射器，管子(zǐ)及注射針內的壓力(lì)，可(kě)能將注(zhù)射(shè)針射(shè)出(chū)傷(shāng)人。
